principi di miologia e di fisiopatologia del muscolo scheletrico - Unipd

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PRINCIPI DI MIOLOGIA E DI FISIOPATOLOGIA DEL MUSCOLO SCHELETRICO Biologia delle miofibre e loro adattamento a lungo termine ai traumi spinali con lesioni del primo (Paraplegia spastica) o del secondo motoneurone (Sindrome da lesione completa della cauda equina) Ugo Carraro Laboratorio di Miologia Traslazionale, Centro di Ricerca Interdipartimentale di Miologia & Istituto di Neuroscienze del C.N.R. c/o Dipartimento di Scienze Biomediche Sperimentali dell’Università di Padova, Viale G. Colombo 3, 35121 Padova, Italia Tel +39 049 8276030; Fax +39 049 8276040 E-mail: [email protected]

Principi di miologia Con il termine Plasticità Muscolare si descrivono tutte le possibili modificazioni di massa e di proprietà anatomofisiologiche, cui va incontro il Tessuto Muscolare Scheletrico (un concetto più dettagliato di: Muscolo, dato che sottolinea il contributo sia delle miofibre che delle componenti tessutali fibro-elastiche , di quelle vasali e del sistema nervoso motorio, sensoriale ed autonomo) al variare delle richieste funzionali e dell’ambiente esterno ed interno, in cui tutto ciò si va attuando. La Figura 3.1 ricorda sinteticamente i rapporti contigui, se non continui, tra biologia, fisiologia, fisiopatologia e franca patologia muscolare, che l’estensione del concetto di Plasticità Muscolare permette di realizzare. Si ribadisce qui che i rapporti tra Normaltà e Patologia sono sempre su base quantitativa, mai qualitativa. Una tale visione permette di ricucire l’apparente discontinuità tra i fenomeni di Atrofia/Eutrofia/Ipertrofia e quelli di Lesione Letale/Rigenerazione muscolare, che vengono solitamente considerarti fenomeni qualitativamente distinti. Realizzate, le prime, da oscillazioni ponderali secondarie a cambiamenti della dieta (digiuno/sovralimentazione) o dell’attività fisica (Inattività o Disuso/Accresciuto esercizio muscolare), le altre, a patologie genetiche (Distrofia Muscolare di Duchenne) o traumatiche (da agenti fisici o chemiotossici) oppure da severe ischemie prolungate per ore (lesioni necrotizzanti massive). Le Figure 3.1 e 3.2 riassumono anche i rapporti tra variazione dell’espressione genica tipo-specifica (muscoli rapidi/lenti, singole miofibre lente o rapide a diversa composizione isomiosinica ed enzimatica) del muscolo adulto sotto gli stimoli trofico-differenziativi ormonali, nutrizionali, di attività/inattività estrema (l’iperplasia compensatoria nelle richieste massimali di attività muscolare e l’inattività combinata con l’ipogravità a medio e lungo termine). In Miologia, corretto è considerare in comuni ambiti di “regolazione dell’espressione genica” le risposte iperplastiche dell’ipertrofia estrema o i processi apoptotici dell’ontogenesi, con i fenomeni selettivi di morte programmata nell’atrofia estrema e gli episodi di franca morte cellulare in patologia. Meccanismi molecolari e cellulari della plasticità muscolare nella evoluzione spontanea delle patologie muscolari e nelle strategie di riabilitazione motoria attiva o passiva. Modelli sperimentali in piccoli animali. Malgrado l'apparente enorme plasticità e resistenza alla lesione a carichi di lavoro semi-massimali, le miofibre muscolari soffrono danni muscolari subletali e letali a carichi di lavoro anche solo di poco superiori a quelli medi del "recente" passato. Mentre la quantificazione degli eventi di necrosi delle miofibre è ben realizzata analizzando i conseguenti eventi di miogenesi rigenerativa, la quantificazione dell'apoptosi delle miofibre, e ancor più di quegli eventi subletali, che vengono descritti come apoptosi dei mionuclei, si confonde con le problematiche ancora non ben risolte della quantificazione delle lesioni reversibili del sarcolemma e dell'omeostasi del calcio intracellulare (meglio, nei diversi compartimenti intracellulari). In realtà, questi problemi si intrecciano con quelli della regolazione del flusso ematico nel microcircolo muscolare, in particolare quando i meccanismi della regolazione fisiologica (iperemia da lavoro e sua regolazione nel tempo) sono sovrastati dall'iperemia infiammatoria, sicchè le miofibre si trovano a sopportare un carico di lavoro, che può ben essere quantitativamente normale, ma in un ambiente fisico-chimico notevolmente alterato. E' questo complesso intreccio di cause/effetti, che rende lo studio di un problema annoso ed apparentemente banale quale quello del ruolo del movimento passivo delle fibre muscolari scheletriche durante le fasi di recupero dell'omeostasi (processi di guarigione), un affascinate tema di ricerca di miologia molecolare e cellulare, raffinato e difficile, troppo spesso semplificato a misure di componenti isolate del sistema (radicali liberi, mediatori chimici dell'infiammazione, citochine, etc.). Anche solo la messa a punto di modelli sperimentali affidabili è quindi un obiettivo essenziale e preliminare della moderna ricerca. Inizieremo la descrizione di questi complessi meccanismi biologici, fisiologici e fisiopatologici utilizzando tre modelli nei roditori. 1. Il processo di mionecrosi e guarigione per miogenesi rigenerativa di lesioni miotossiche massive ottenute mediante infiltrazione di anestetici locali in masse muscolari rese temporaneamente ischemiche mediante l’applicazione di lacci emostatici.

MUSCLE PLASTICITY TROPHISM & DEGENERATION ATROPHY

HYPOTROPHY

EUTROPHY HYPERTROPHY max-HYPERTROFHY

MODULATION OF PROTEIN TURNOVER

SEVERE ATROPHY APOPTOTIC DEATH DYSTROPHY

Messina Seminar - March 15, 2005

HYPERPLASIA

Prof. Ugo Carraro - Applied Myology Lab - University of Padova

Figura 3.1 Relazione tra Plasticità Muscolare “normale” e sua estensione a condizioni fisiopatologiche o patologiche. 2. Il processo di atrofia da denervazione “periferica” permanente (ad esempio per sciatectomia) nei muscoli degli arti (in cui lo stiramento passivo residuo delle miofibre, diminuisce fino a scomparire per la fissazione delle articolazioni conseguente alla fibrosi delle capsule articolari) verso quello nell'emidiaframma dopo frenicotomia. In questo secondo caso, lo stiramento passivo cronico esercitato dall'emidiaframma attivo induce inizialmente una paradossa risposta ipertrofica e poi impedisce la sostituzione lipo-fibrotica (lipodistrofia) delle miofibre severamente atrofiche, che si attua nei muscoli "denervati e fissati" entro l’ottavo-dodicesimo mese dalla sciatectomia. Ricordiamo che l’atrofia dovuta all’inattività e riduzione del carico dovuta a lesioni del motoneurone centrale, non producono lipodistrofia neppure venti anni dalla lesione midollare. 3. Le lesioni indotte dall'esercizio spontaneo, che topi e ratti amano compiere durante l'attività notturna, quando abbiano a disposizione una ruota libera nel ristretto ambiente in cui sono abituati a vivere (gabbia da laboratorio). In tal caso compaiono già all'indomani e poi evolvono nella successiva settimana lesioni muscolari sub-letali, ma anche letali, che allora inducono eventi di rigenerazione muscolare. E' in questo terzo modello murino (la guarigione delle lesioni da esercizio fisico volontario, eccezionalmente prolungato) che, per poter fissare le condizioni ottimali dei controlli pseudo-trattati, possiamo descrivere l'effetto delle manipolazioni che i piccoli animali debbono subire, per poterli utilizzare in test di innocuità (primum non nocere) e di efficacia di terapie riabilitative fisiche. I muscoli possono essere analizzati per quantificare: 1. le variazioni del trofismo, mediante analisi di sintesi e degradazione dei messaggeri (mRNA); 2. la permeabilità del sarcolemma (mediante traccianti selettivi fluorescenti e la misura del rilascio di enzimi intracellulari nel sangue); 3. l’espressione di shock proteins sia nel muscolo che nel siero e correlatamente la riprogrammazione genica, che media la risposta cellulare al danno, e cioè fattori trascrizionali quali NF-kB e AP-1. 4. l'entità di eventi di morte/rigenerazione di miofibre (mediante analisi molecolari ed immunoistochimiche dei fattori pro- ed anti-apoptotici e delle isoforme della miosina, rispettivamente). Ottimizzate le condizioni generali dell'esperimento, si possono analizzare gli effetti dell'attività fisica spontanea negli animali esposti ad un incremento improvviso di esercizio fisco, paragonando gruppi di animali esposti per una sola notte all'esercizio rispetto a quelli lasciati per il successivo periodo di studio nelle gabbie provviste di ruote libere. Questi ultimi possono essere confrontati anche con animali fatti crescere fin dal periodo di svezzamento in gabbie attrezzate di ruote monitorate. E’ così possibile anche documentare le variazioni di attività fisica durante il periodo sperimentale. Per i dettagli sulle attrezzature e le strumentazioni e sui metodi analitici morfologici e molecolari si veda Rossini, et al. 2002. Basic Appl Myol 12, 277-286 [33].

MUSCLE PLASTICITY ISOGENES’ SWITCHING (FIBER TYPING) FAST FIBERS (2A, 2B, 2X/d)

MYOFIBER DEATH

SLOW

REGENERATION

NECROTIC DEATH

REGENERATIVE MYOGENESIS

Ontogenetic development Denervation/Reinnervation Extreme increase of function

GENERATIVE MYOGENESIS

HYPERPLASIA

Heidelbergi, October 13, 2003.

Prof. Ugo Carraro - Applied Myology Lab - University of Padova

Figura 3.2 Relazione tra Plasticità Muscolare “normale” e sua estensione a condizioni fisiopatologiche o francamente patologiche. Up- and down-regulation di isogeni delle miosine contrattili e dell’assetto enzimatico, inclusi i geni regolatori della mitocondriogenesi. Si possono in tal modo raccogliere i dati preliminari agli studi che hanno come obiettivi a medio termine: 1. la determinazione del ruolo dello stiramento passivo (anche secondario ad attività contrattile dello stesso o di altri gruppi muscolari) sulla plasticità muscolare in miopatie secondarie a patologie neurogene, da disuso, e primariamente o secondariamente infiammatorie. 2. lo studio delle interazioni molecolari, cellulari e tessutali tra miofibre e microcircolo intramuscolare durante e dopo cicli di terapie fisiche (stiramento passivo, termoterapia, lutoterapia, elettroterapia, fototerapia) e i loro effetti positivi o negativi sulla miogenesi (ipertrofia estrema e rigenerazione), sull'apoptosi mionucleare (atrofia severa) e poi cellulare ed infine sui processi di adattamento che possono ridurre fino ad annullare la necrosi delle miofibre. Sono questi i contesti biologici anomali in cui possono venirsi a trovare le popolazioni di miofibre muscolari. Essi sono frequenti nella traumatologia dell'atleta elitario e nelle miopatie neurogene o infiammatorie, in particolare nell'anziano sedentario. Sono anche più accentuati seppure più rari, nelle malattie genetiche e nelle sequele di lesioni del midollo spinale, sia lasciate alla loro spontanea evoluzione, che modificate nel loro decorso da strategie passive ed attive di riabilitazione motoria. Miogenesi rigenerativa. Potenzialità rigenerative del tessuto muscolare scheletrico adulto Le figure 3.3 e 3.4 riassumono i principali eventi della miogenesi rigenerativa nel tessuto muscolare adulto. La Figura 3.3 indica le origini certe o putative di cellule miogeniche mobilizzate da una lesione delle miofibre. Sono indicate le cellule satelliti, cellule miogeniche locali separate dalla miofibra ma alloggiate sotto la comune membrana basale, ed ancora in forma ipotetica le cellule miogeniche circolanti. In Figura 3.4, l’evoluzione di una miofibra necrotica attraverso la fase demolitiva (fase di toeletta macrofagica) e quella plastica di rigenerazione per attivazione delle cellule satelliti e loro moltiplicazione per diversi cicli replicativi. Poichè un ciclo dura circa 12 ore e le cellule satelliti sono il 2-8 % dei mionuclei totali, in 3 giorni si realizza il recupero di tutti i mionuclei persi, e cioè in quattro - sei cicli di replicazione esponenziale dei mioblasti. Segue man mano la loro fusione a formare i miotubi, entro cui iniziano ad accumularsi le proteine contrattili, prima quelle di tipo embrionale e poi, con il ricontatto sinaptico, quelle dipendenti dalle caratteristiche differenziative dei motoneuroni spinali, che eventualmente reinnervano la popolazione di miofibre rigenerate.

circulating (myogenic) stem cells (?) Basal lamina Satellite cell MYONUCLEI

[Resident myogenic cell]

Sarcolemma

Figura 3.3 Rigenerazione muscolare nell’adulto. La potenzialità rigenerativa è sostanzialmente associata con la presenza di “cellule satelliti”, mioblasti sequestrati sotto la comune membrana basale che collega, trasmettendo le forze interne alla rete extracellulare di collagene che convoglia gli eventi di scorrimento dei filamenti della contrazione nei tendini. Ancora discussa, o semplicemente negata, è la presenza significativa di cellule miogeniche nel sangue.

Figura 3.4 Rigenerazione di miofibra adulta. Durante la fase infiammatoria demolitiva operata da PMN e macrofagi, le cellule satelliti si attivano e si moltiplicano, sotto gli stimoli positivi o negativi delle citochine liberate dai macrofagi e poi dagli stessi mioblasti (Cantini and Carraro, JNEN 1995[2]; Sandri et al. J Leuc Biol, 2001[34]). Contemporaneamente alla scomparsa dei macrofagi, i mioblasti fondono a miotubi, che iniziano a produrre ed accumulare proteine contrattili sarcomeriche embrionali. La fase di differenziazione terminale è sotto il controllo del tipo di motoneurone che eventualmente contatta la nuova fibra. Essa aveva però raggiunto, circa un quarto della massa di una normale miofibra adulta innervata. Le miofibre rigenerate, anche se non reinnervate, sopravvivono molti mesi nei muscoli rigenerati dei roditori.

Figura 3.5 Eventi di reinnervazione spontanea in un muscolo soleo denervato da 4 mesi. A, Ematossilina-Eosina; B, ATPasi pH 10.4, le miofibre scure sono di tipo rapido (II); C, SDH, le miofibre più intensamente colorate sono di tipo lento (I). Evidente la presenza di type-grouping nei pannelli B e C, e di piccole miofibre denervate nel pannello A. Poichè la distribuzione a scacchiera delle unità motorie viene generalmente persa, si rende evidente il più sicuro dei marcatori cellulari di reinnervazione, il cosidetto type-grouping (Figura 3.5). Controllate dai motoneuroni ad attività fasica o tonica, e certamente anche sotto l’effetto del diverso lavoro da essi imposto, maturano completamente le caratteristiche differenziative delle miofibre, compresa la massa media, caratteristica delle diverse unità motorie dei muscoli adulti normali. Va però segnalato che anche in assenza del nervo ciascuna miofibra rigenerante raggiunge, per intrinseca spinta miogenica, una massa di un quarto/ un terzo di quella propria delle miofibre innervate adulte. Successivamente prevale la “involuzione” dovuta all’eventuale mancata innervazione (Mussini et al., JNEN 1987)[31]. La popolazione di miofibre rigenerate in assenza dell’innervazione motoria permane a lungo (mesi nel ratto), sicchè eventuali eventi di lesione letale/ rigenerazione di miofibre può contribuire alla massa muscolare permanentemente denervata. Tutto ciò si ripete a lungo nel tempo: il contributo di questi eventi rigenerativi deve essere pertanto considerato come un meccanismo compensatorio, seppure sub-ottimale, se si vuole produrre una più realistica descrizione del processo di involuzione del muscolo scheletrico permanentemente denervato, sia in modelli murini (Adami et al., Basic Appl. Myol, in press; Salviati et al., 2006 Basic Appl. Myol, in press), che nell’uomo (Carraro et al., 2005. AO [7]; Caccavale et al., 2006. Basic Appl. Myol, in press). Un esempio chiaro della potenzialità rigenerativa e del mantenimento del trofismo anche in assenza di reinnervazione è dato dai nostri recenti risultati nel Tibiale Anteriore (TA) di ratti sciatectomizzati. Il TA va incontro ad una necrosi/rigenerazione massiva (completa) per l’azione combinata di 30 minuti di ischemia e l’infiltrazione di anestetici locali come la bupivacaina (Figura 3.6). Le miofibre rigeneranti sono riconosciute per la loro piccola dimensione, il nucleo centrale e l’intensa marcatura con l’anticorpo anti-N-CAM. Miofibre di tipo rapido, di simile (o maggiore dimensione) sono presenti sia a 2 settimane, quando presentano ancora una modesta positività all’anticorpo contro la miosina embrionale e 2-3 mesi dopo la lesione/rigenerazione anche in ratti permanentemente sciatectomizzati.

A

B

Figura 3.6 Tibiale Anteriore di ratto. Tutte le miofibre hanno sarcolemma positivo (rosso) all’anti-N-CAM, un marcatore di miogenesi e di denervazione. A, 5-giorni e B, 15-giorni di rigenerazione dopo necrosi massiva indotta da 30-min ischemia & bupivacaine. In A, i nuclei sono colorati in azzurro con Hoechst 33258.

Tabella 3.1. Marcatori molecolari di miogenesi rigenerativa in presenza od assenza del nervo Transcription Factors ___________________________

Myosin Isoforms ________________

Quiescent Satellite cell

MNFβ (Myogenic Nuclear Factor β)

Non-muscle MHC

Activated Satellite cell

MyoD

MHC-emb

Proliferating Myoblasts

MyoD, Myogenin

MHC-emb

N-CAM

Myotube & Early myofiber

MyoD, Myogenin

MHC-emb MHC-neo

N-CAM N-CAM

Adult Denervated Myofiber (early)

MHC-1S MHC-2A MHC-2X MHC-2B see Innervated

N-CAM

Adult Denervated Myofiber (late)

MHC-2A-(like?)

Adult Innervated Myofiber Adult Reinnervated

Integrins _____________

Il muscolo denervato: un motore al minimo Numerose cause genetiche ed acquisite determinano gravi deficit motori, a loro volta responsabili di lunghi periodi di pessima qualità di vita ed infine della conclusione drammatica della storia dei soggetti affetti. Pediatri e neurologi dibattono l’etiologia e la patogenesi di patologie ereditarie come la sclerosi laterale amiotrofica, ed hanno molte speranze ma poche certezze terapeutiche. Nonostante l’enorme massa di conoscenze nelle patologie motorie posttraumatiche, medici dello sport, ortopedici, chirurghi plastici, fisiatri e fisioterapisti si scontrano con difficoltà insormontabili in una percentuale ancora troppo elevata di casi [15,20]. Nonostante lo sviluppo tumultuoso negli ultimi decenni delle tecniche diagnostiche e degli approcci microchirugici, un salto qualitativo nel trattamento delle patologie muscolari neurogene potrà essere atteso solo dall’applicazione in ambito clinico di risultati né programmabili né prevedibili della ricerca miologica fondamentale. E’ anche vero però che, seppur raramente, osservazioni della ricerca clinica aprono prospettive inattese di ricerca fondamentale. Un esempio di trasferimento dei risultati della ricerca libera [1,3,4-6,8-10,31,33,36] alla clinica speriamo possa venire dalla validazione di strategie riabilitative del muscolo scheletrico permanentemente denervato. Negli ultimi anni abbiamo anche accumulato risultati interessanti (e da noi del tutto inattesi) sul decorso dell’atrofia da denervazione del muscolo scheletrico umano a seguito di lesioni irreversibili del motoneurone spinale. Chiameremo questa condizione denervazione flaccida, non solo per comodità, ma anche per il ruolo patogenetico dell’assenza di ripetuti eventi di tensione cellulare nella progressione da semplice atrofia a degenerazione del tessuto muscolare denervato perifericamente. Ricordiamo che nel caso di lesioni del primo motoneurone, sia a livello corticale, che in lesioni spinali, l’atrofia da disuso conseguente non supera mai la perdita di massa muscolare superiore al 50-70%, forse in relazione al mantenimento dell’arco riflesso, che induce contrazioni talora eccessive (tipiche della paraplegia spastica), ma in ogni caso in presenza di carichi muscolari limitati od assenti. La figura 3.7 mostra che i profili delle miofibre, che nel tessuto normale sono separate da quantità virtuali di connettivo lasso, sono rotondeggianti e ben connesse. Sia nel medio che nel lungo termine i muscoli di soggetti affetti da paraplegia spastica mostrano invece profili delle miofibre ben separati dall’interstizio (modesta fibrosi/edema.) Le miofibre hanno diametri molto più variabili presentando sia miofibre rigonfie (ipertrofiche?) che rare miofibre di piccolo o piccolissimo diametro. Coerentemente, sia a medio che a lungo termine aumenta nello stesso grado il connettivo lasso, mentre molto rari restano gli adipociti e la fibrosi. Non ci sono differenze significative tra muscoli paralizzati da 3-5 o 15-20 anni (p = 0.31). Essi sono invece ambedue molto significativamente diversi dalla serie dei muscoli umani normali (p < 0.001). Nelle denervazioni periferiche per lesioni dei nervi motori o nella paraplegia flaccida dovuta a lesioni traumatiche od ischemiche del soma del motoneurone spinale, l’atrofia progredisce fino ad una completa degenerazione del tessuto muscolare scheletrico, che viene sostituto da tessuto adiposo ed infine dalla fibrosi tessutale (distrofia muscolare neurogena genetica od acquisita).

Figura 3.7 Aspetto istologico e distribuzione dei tipi di tessuto (muscolo, grasso, connettivo lasso e fibroso) nella paraplegia spastica. H&E. A, medio-termine (2-4 anni), e B, lungo-termine (15-20 anni) di paraplegia spastica. I profili delle miofibre, che nel tessuto normale sono separate da quantità virtuali di connettivo lasso, sono rotondeggianti e ben connesse. Sia nel medio che nel lungo termine i muscoli di soggetti affetti da paraplegia spastica mostrano profili delle miofibre ben separati dall’interstizio (modesta fibrosi/edama). Le miofibre hanno diametri molto variabili presentando sia miofibre rigonfie (ipertrofiche?), che rare miofibre di piccolo o piccolissimo diametro. Tra di loro di composizione tessutale molto simile, le biopsie a medio e a lungo termine sono molto diverse da quelle normali. Calibrazione: 100µm. In Figura 3.8 si può apprezzare l’entità dei cambiamenti osservati nei prelievi bioptici eseguiti prima del FES training nei soggetti arruolati nel Trial Europeo RISE (Alzati!). Sorprendentemente i muscoli ad un anno circa dalla lesione spinale presentano muscoli ancora ben conservati, seppure notevolmente atrofici (B). E’ solo dal terzo anno che prevalgono gli aspetti francamente distrofici (sostituzione adiposa e fibrosa della popolazione di miofibre denervate). L’analisi istologica non è però completamente rappresentativa del decorso post-lesionale, dato che tra quello che appare ad una osservazione superficiale tessuto connettivo lasso sono invece presenti numerosissime miofibre muscolari “severamente” atrofiche.

Figura 3.8 FES Training di muscoli umani denervati-degenerati. Aspetti istologici a breve, medio e lungo termine. Ematossilina-Eosina. Tessuto muscolare umano. A, normale; B, 0,9 anni di denervazione; C, 3,3 anni di denervazione; D, 8,7 anni di denervazione. Dopo quasi un anno di denervazione periferica il muscolo presenta aspetti di media atrofia. Solo dopo tre anni prevale la sostituzione lipo-fibrotica, molto accentuata dopo circa 10 anni di denervazione flaccida.

Esse hanno cioè perso completamente il materiale contrattile e presentano una det tutto peculiare distribuzione a gruppi dei nuclei separati da tratti di miofibre in cui nuclei e proteine sarcomeriche sono assenti (C). Le miofibre denervate sembrano cioè sopravvivere molto più a lungo di quanto generalmente accettato e descritto in letteratura, non solo nei muscoli sperimentali dei roditori, ma anche in quelli umani di soggetti con lesioni del secondo motoneurone (si veda il pannello centrale in Figura 3.9 e l’immagine in sezione longitudinale in Figura 3.10). Queste ipotesi patogenetiche sono molte rinforzate dai risultati eclatanti di recupero trofico ed in parte funzionale (la recuperata abilità di sostenere contrazioni tetaniche sotto carico) mediante una strategia riabilitativa di stimolazione elettrica funzionale della muscolatura flaccida (che deve naturalmente essere continuata per tutta la vita del soggetto, dato che deve supplire all’assenza di eventi contrattili spontanei) [12-14,16,17,19,21,24-28,30,35].

EU Network 02191 - RISE (ALZATI!)

3.3-anni Paraplegia Flaccida

1. Le miofibre umane sopravvivono in assenza di nervo molto più a lungo di quanto è generalmente accettato (vari anni) 2. Cicli di morte/rigenerazione delle miofibre contribuiscono alla persistenza a lungo termine del tessuto muscolare

3. Un “permanent FES training” inverte il processo atrofico nel paraplegico, aumentando il trofismo delle miofibre rigenerate Figura 3.9 Conclusioni del progetto EU Network 02191 - RISE (ALZATI!).

Figura 3.10 Nel tessuto connettivo lasso sono presenti numerose miofibre muscolari “severamente atrofiche”, che hanno perso completamente il materiale contrattile. Esse presentano una peculiare distribuzione dei nuclei a gruppi, separati da tratti di miofibre in cui anche i nuclei oltre alle proteine sarcomeriche sono assenti. Sebbene restino alcune questioni aperte nella diagnostica bioptica (si veda la Tabella 3.2), i risultati del Progetto Europeo RISE (ALZATI!) indicano la reversibilità della degenerazione muscolare secondaria a lesioni permanenti del motoneurone spinale ed incoraggiano a riprendere in considerazione strategie di stimolazione elettrica a lungo termine della muscolatura scheletrica anche nei casi di atrofie muscolari secondarie a lesioni del primo motoneurone o nei più complessi casi di trasferimenti di lembi muscolari liberi (e cioè denervati) resi possibili dalla microchirurgia ricostruttiva vasale. La serie molto numerosa e ben distribuita nel tempo di biopsie di muscoli cronicamente “flaccidi” del Trial EU RISE ci ha anche permesso di constatare, con nostra sorpresa, una straordinaria “resistenza al disuso da denervazione periferica” del tessuto muscolare scheletrico umano, almeno in confronto alla cinetica di atrofia/degenerazione dei muscoli degli arti nel ratto [1,3,4-6,8-10,31,33,36]. Il processo che evolve in mesi (quattro-sei) fino all’apparente scomparsa di tutte le miofibre nel ratto (a dodici mesi), impiega nell’uomo anni (due-tre). Risultati del tutto concordanti sono stati accumulati nell’ambito di uno studio prospettico di biopsie prelevate da lembi muscolari liberi [21,22].Sebbene le miofibre umane perdano in pochi mesi la capacità di contrarsi per stimolazione diretta con gli elettrostimolatori di normale uso clinico (le miofibre appena curarizzate rispondono invece a correnti ben focalizzate quasi con la sensibilità del nervo), a causa della disorganizzazione dei tubuli T (che normalmente trasmettono il segnale per il rilascio del calcio all’interno della miofibra) e dei sarcomeri (Figura 3.11), esse mantengono per tempi inaspettatamente lunghi la capacità di controllare il potenziale di membrana a riposo e di condurre potenziali d’azione (Francini et al., Basic Appl. Myol. 2006, in press; Squecco et al. Am J. Physiol - Cell, in preparation). Tabella 3.2 Diagnostica bioptica delle atrofie/degenerazioni muscolari secondarie a lesioni permanenti del motoneurone spinale. Definizioni e problemi aperti. A. Ongoing EU Trial RISE Quali criteri utilizzare per definire degenerato un muscolo denervato umano? Quando avviene il passaggio dalla fase di semplice atrofia alla degenerazione muscolare? B. PreRISE subjects (dmFES-trained human muscle) Quali criteri clinici e bioptici permettono di identificare la denervazione completa da lesione del motoneurone spinale? Che cosa ci dobbiamo aspettare nella denervazione muscolare secondaria a lesioni del motoneurone corticale? Qual è il grado di incertezza diagnostica nella serie di soggetti RISE? Siamo in grado mediante microscopia a luce trasmessa o microscopia elettronica (o qualsiasi altro approccio diagnostico) di identificare in una biopsia eterogenea: 1. Miofibre Normali; Miofibre denervated entro un anno dalla lesione del motoneurone spinale; 3. Miofibre severamente atrofiche; 4. Miofibre conservate/recuperate/rigenerate dalla stimolazione elettrica funzionale secondo la strategia di Vienna dmFES; Miofibre restituite all’eutrofia mediante FES-training (e cioè, miofibre spastiche riabilitate mediante FES)? ________________________________________________________________________________________________

Figura 3.11 Ruolo dell’apparato di accoppiamento eccitazione-contrazione nella progressione dall’atrofia alla distrofia del muscolo scheletrico umano denervato per lesioni spinali o periferiche del secondo 1. Fomotoneurone. rschungsziel: Già nella fase di atrofia semplice si attua la dissociazione tra sarcolemma (tubuli T) e reticolo sarcoplasmatico. In tal modo anche gli eventuali eventi di fibrillazione, che caratterizzano le Maintaining restoring excitability of effetti atrophic fasi acute della or denervazione motoria, cessano di produrre meccanicimyofibers… e metabolici importanti per il blocco del rilascio del calcio dalle triadi. … IlofFESsarcolemma, sarcoplasmatic reticulum (SR), triads. training blocca la degradazione del sistema costituito da tubuli T e Reticolo sarcoplasmatico e ne favorisce la riorganizzazione nelle miofibre severamente atrofiche

Tierexperiment 2003 angesucht Arbeit am Tier und Menschen bereits publiziert Sarcoplasmic T-tubule Reticulum Sarcolemma Mitochondria

Erregungsübertragung

15 Monate denervierter Muskel, Mensch

FES trainierter denervierter Muskel, Mensch Kern H, Boncompagni S, Rossini K, Mayr W, Fanò G, Zanin ME, Podhorska-Okolow M, Protasi F, Carraro U. Long-term denervation in humans causes degeneration of both contractile and excitation-contraction coupling apparatus which is reversible by functional electrical stimulation (FES): A role for myofiber regeneration? Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 2004; 63: 919-931.

Diversamente, l’apparato di accoppiamento eccitazione-contrazione ha un ruolo nella progressione dall’atrofia alla distrofia del muscolo scheletrico umano denervato per lesioni spinali o periferiche del secondo motoneurone. Già nella fase di atrofia semplice si attua la dissociazione tra sarcolemma (tubuli T) e reticolo sarcoplasmatico. In tal modo anche gli eventuali eventi di fibrillazione, che caratterizzano le fasi acute della denervazione motoria, cessano di produrre effetti meccanici e metabolici importanti a causa del conseguente blocco del rilascio del calcio dalle triadi. Il FES training blocca la degradazione del sistema costituito da tubuli T e Reticolo sarcoplasmatico e ne favorisce la riorganizzazione nelle miofibre severamente atrofiche. Solo molti mesi (nel ratto) od anni (nell’uomo) di denervazione periferica producono nelle miofibre l’incapacità di rispondere anche ad elevatissime correnti elettriche. La parziale sostituzione del volume muscolare perso con tessuto adiposo e fibroso è un processo relativamente precoce, la progressiva scomparsa delle miofibre (forse per veri processi terminali di apoptosi) è un evento che compare nel ratto dopo più di un anno di denervazione (un terzo dell’aspettativa di vita dei ratti di laboratorio) e deducibile nel caso di biopsie umane prelevate dopo decenni di denervazione, come è descritto nelle sequele tardive della poliomielite.

Figura 3.12 Eventi rigenerativi nel muscolo denervato con e senza FES: immunoi-istochimica e microscopia elettronica. A) nove-mesi di denervazione e B) 6-anni di denervazione. Le miofibre rigenerate precoci si colorano in verde con l’anticorpo anti-miosina embrionale. La doppia esposizione anti-MHCemb/Hoechst 33258 mostra che alcuni nuclei blu sono localizzati al centro delle fibre. Scale bar: 100 µm. C) Microscopia Elettronica di miotubi rigeneranti nel muscolo denervato da lungo tempo: due strati di lamina basale (le punte di freccia nere e bianche puntano sullo strato vecchio e su quello nuovo della membrana basale). Sono visibili anche alcuni mitocondri, e delle triadi ben sviluppate (frecce sottili). Calibro: 1.0 µm. D) 7-anni di denervazione seguiti da 4-anni di FES Training e E) 5-anni di denervazione seguiti da 2-anni di FES Training. Le miofibre rigenerate sono colorate in verde dall’anticorpo antimiosina. La doppia esposizione anti-MHCemb/Hoechst 33258 mostra anche nuclei centrali (in blu). Si noti il maggior calibro delle miofibre dopo FES Training.

Nel caso di muscoli umani solo tediosi e difficili studi autoptici potranno dirimere la questione: la microscopia elettronica nel caso della nostra serie di biopsie RISE mostra la presenza di numerose miofibre severamente atrofiche (lunghi tubi contenenti gruppi di mionuclei distanziati da regolari porzioni mioplasmatiche prive completamente di miofibrille e mionuclei [21]. Le caratteristiche morfologiche del tessuto muscolare cronicamente denervato nei roditori suggeriscono che nelle fasi di comparsa di eventi di apoptosi/necrosi delle miofibre questi eventi lesivi vengano seguiti (almeno per una minoranza di casi) da cicli ripetuti di rigenerazione muscolare [21]. Le biopsie che abbiamo studiato nell’ambito del progetto RISE presentano tra la maggioranza delle miofibre con caratteristiche tipiche della denervazione (piccole miofibre angolate o appiattite), poche piccole fibre rotonde e positive con un anticorpo monoclonale contro la miosina embrionale. Poiché l’espressione dei geni embrionali dura nella miogenesi rigenerativa poche giorni, anche nel caso di muscoli aneurali [1,3,6,8,9,31,33], possiamo concludere che abbiamo prove dirette di eventi rigenerativi in tutte le biopsie muscolari raccolte da soggetti tra 1- e 37-anni dalla lesione spinale irreversibile. Anche nelle biopsie dei soggetti trattati da 2- a 10-anni con stimolazione elettrica funzionale (FES) gli eventi rigenerativi sono presenti, ma in una percentuale significativamente inferiore rispetto ai muscoli cronicamente denervati (DDM) per lesione permanente del motoneurone spinale (miofibre rigeneranti per mm2 di area della sezione criostatica: 0.8+/-1.3 nelle biopsie FES vs. 2.3+/-2.3 nelle biopsie DDM, media+/- SD, p = 0,011). Queste osservazioni sono ulteriori solide prove dell’efficacia della strategia riabilitativa mediante FES messa a punto a Vienna dal dr. Kern. Nel loro complesso il data base delle analisi bioptiche che abbiamo accumulato su soggetti spastici, flaccidi e flaccidi trattati dimostrano che il protocollo di stimolazione elettrica è sicuro (primum non nocere): come minimo non induce più eventi di danno/rigenerazione muscolare della denervazione per se [7]. La morfometria delle miofibre conferma che il FES training è anche efficace, almeno come fattore eutrofizzante (vedi pannelli inferiori nelle Figure 3.11 e 3.12). Tutte queste osservazioni sulla capacità inattesa delle miofibre muscolari scheletriche di sopravvivere a lungo all’assenza di eventi contrattili (denervazione flaccida con degenerazione muscolare accompagnata da eventi di miogenesi rigenerativa) aprono nuove prospettive sull’uso (prossimo, futuro o futuribile) nella ricostruzione di muscoli avulsi o chirurgicamente trasposti [35] o di tessuto muscolare ectopico (ad esempio, per migliorare i processi di guarigione nell’infarto miocardico) [11,32]. Certamente esse avranno presto un ruolo nella prevenzione/cura delle complicanze tardive (ulcere da decubito non altrimenti risolvibili) in soggetti allettati per patologie cardiocircolatorie, metaboliche (diabete) e/o neurodegenerative centrali od immobilizzati per lesioni spinali (genetiche o post-traumatiche) o dei nervi periferici, in particolare nei paraplegici flaccidi. Le prospettive sono anche più incoraggianti per la più ampia popolazione di soggetti con deficit di mobilità per lesione dei motoneuroni corticali o delle vie piramidali [15,20]. In tutti questi casi stanno sollevando grandi aspettative: 1. strategie di “allenamento” (in realtà di recupero dalle conseguenze di gravi e meno gravi conseguenze del disuso muscolare), che abbiano le loro basi razionali nelle conoscenze delle risposte dei canali sarcolemmali meccano-attivati, che sembrano svolgere un ruolo regolativo fondamentale del trofismo “basale” delle miofibre muscolari, in particolare in miofibre che hanno perso la capacità di produrre e sostenere contrazioni tetaniche. 2. La ricerca, la validazione e lo sviluppo di nuovi approcci di stimolazione elettrica intra-muscolare (diretta od indiretta, vale a dire tramite le terminazioni nervose para- od intra-muscolari), che possano realizzare selettive o sequenziali stimolazioni coordinate di più gruppi di fibre e/o muscoli. Naturalmente una tale strategia richiede la collaborazione di Miologi, Matematici, Fisici e Bioingegneri. Il gruppo di Vienna con cui collaboriamo include fortunatamente oltre al dr. Kern, il responsabile delle ricerca clinica ed ideatore della strategia riabilitativa per il muscolo denervato, un gruppo multidisciplinare di esperti. La sopravvivenza a lungo termine (anni) delle miofibre denervate apre nuovi scenari anche di ricerca muscolare fondamentale (quali meccanismi genetici od epigenetici regolano il mantenimento di miofibre vitali, anche se completamente prive di materiale contrattile, ma capaci di produrre e trasmettere il potenziale d’azione?) e di prospettive cliniche (quale è il ruolo dello stiramento passivo in questa regolazione e quali le possibilità di modularne farmacologicamente la risposta nelle miofibre a fini riabilitativi trofico/funzionali?). Le nostre pionieristiche osservazioni sulla peculiare resistenza alla denervazione dell’emidiaframma di ratto cronicamente denervato, correlabile con la permanente ritmica tensione imposta dall’emidiaframma innervato controlaterale (che naturalmente va incontro ad ipertrofia vicariante), indicano che questo modello sperimentale potrebbe offrire facile materiale di studio (l’emidiaframma è la preparazione neuromuscolare per eccellenza della farmacologia della contrazione neuromuscolare) per comprendere e valorizzare i meccanismi molecolari sottesi ai movimenti attivi e passivi delle fibre muscolari scheletriche e pesare il ruolo dei fattori genetici e di quelli epigenetici nella regolazione del trofismo tessutale. Si veda una delle tante rassegne sull’argomento [18, How cells (might) sense gravity] e più sopra l’accenno ai canali per il calcio attivati dalla tensione del sarcolemma delle miofibre. Altre domande fondamentali aspettano risposte dai ricercatori di base: Perchè ci sono così importanti differenze nella suscettibilità all’atrofia post-denervazione tra specie diverse? Siamo di fronte a meccanismi regolativi legati alla longevità, alla massa delle miofibre o ad altre caratteristiche metabolicoormonali delle diverse specie [16]? La nuova ipotesi che favoriamo, e vorremmo testare in studi di miologia comparata, è che la sopravvivenza delle miofibre alla denervazione periferica sia una caratteristica pre-programmata (genetica) correlata alla “lunghezza” degli

arti: le miofibre sarebbero “capaci di attendere” tutto il tempo che è necessario perchè una lesione all’anca del nervo sciatico possa guarire per rigenerazione degli assoni e reinnervazione dei muscoli dell’arto inferiore (zampa o piede). E’ una ipotesi semplificatrice, ma che ha una qualche ragione finalstica, un valore selettivo, per le specie che contano sulla mobilità fin dalla più giovane età per procacciarsi il cibo e/o per sfuggire ai pericoli. Un’altra ipotesi correla la longevità delle miofibre denervate al loro diametro medio, con l’idea che vi sia una “riserva di trofismo” nella massa delle miofibre. In ogni caso è sorprendente che ad una domanda tanto semplice (quanto sopravvive una miofibra muscolare umana denervata? o rigenerata in permanente assenza di nervo, un caso sperimentalmente più interessante) non si trovi risposta nella letteratura dedicata alle problematiche della reinnervazione muscolare. Più correttamente, io non ho trovato tale risposta con una ricerca bibliografica, spero accurata, in PUBMED. Tante domande stuzzicano la curiosità dei ricercatori, ma esse devono stimolare anche l’interesse di quanti nelle professioni cliniche credono che il trasferimento delle conoscenze sia certamente un processo ineluttabile, ma che va sostenuto ed abbreviato da un continuo e reciproco scambio di opinioni, progetti, critiche, incoraggiamenti e finanziamenti tra ricercatori iper-specializzati (delle scienze di base) ed i professionisti iper-specializzati delle arti (speriamo presto, scienze) ludico/marziali e sanitarie. Referenze 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21.

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